Als Zwilling am 11. Juli 1970 in Springfield, Ohio, geboren, wuchs Justin Chambers mit einem weiteren Bruder und zwei älteren Schwestern auf. Der Schauspieler mit deutschen und irischen Wurzen wurde schließlich nach seinem High School-Abschluss in einer Pariser U-Bahn als Model entdeckt. Neben Jobs für "Calvin Klein" modelte er in Europa, den USA und Japan für Mode-Größen wie "Armani" und "Dolce und Gabbana".
Später entschied sich Justin Chambers dann allerdings dazu, lieber eine Schauspielkarriere einzuschlagen. Er zog nach New York und studierte vier Jahre lang bei den "HB Studios" und den "Ron Stetsons Studios". Nach einigen kleinen TV-Rollen folgten schnell Auftritte in Filmproduktionen wie "Liberty Heights" und "The Wedding Planer". 2003 wurde er für eine der Hauptrollen in der Serie "Cold Case" gecastet, spielte aber aus ungeklärten Umständen in nur vier Folgen mit.
Zwei Jahre später sollte er jedoch mit "Grey's Anatomy" seinen endgültigen Druchbruch feiern. In der Rolle des smarten Dr. Alex Karev gewann er nicht nur einen "Screen Actors Award", sondern ist bis heute darin zu sehen.
Privat ist Justin Chambers seit 1993 mit der ehemaligen Modelagentin Keisha verheiratet. Das Paar hat fünf Kinder: vier Mädchen und einen Jungen, darunter auch ein Zwillingspärchen. 2008 musste der Schauspieler einen gesundheitlichen Schlag in seinem Steckbrief verbuchen. Er ließ sich aufgrund von Erschöpfung und Schlafstörungen in das "UCLA Medical Centre" einweisen.