Amy Acker wurde 1976 in Dallas, Texas, als ältestes von vier Kindern eines Rechtsanwalts geboren. Zunächst hatte sie den Wunsch, Tänzerin zu werden, musste sich aufgrund einer Knie-Operation jedoch gegen diesen Traum entscheiden. Bereits auf der Highschool stand sie im Schultheater auf der Bühne, was sie schließlich dazu veranlasste, Schauspielerei zu studieren. Zwischen 1996 und 1999 studierte Amy Acker schließlich Schauspiel mit Schwerpunkt Theater an der "Southern Methodist School" in Dallas.
Nach dem Studienabschluss arbeitete die Schauspielerin acht Monate beim "American Players Theater" in Wisconsin. Im November 2000 kam Amy Acker nach Los Angeles, wo sie sich für das "Buffy"-Spin-Off "Angel - Jäger der Finsternis" vorstellte und prompt die Rolle der Winifred Burkle erhielt. 2003 gewann sie für diese Rolle den "Saturn Award", ein Jahr zuvor spielte sie eine kleine Nebenrolle in Spielbergs "Catch Me If You Can". Nach dem Serienende von "Angel" konnte sie ihrem Steckbrief zahlreiche erfolgreiche US-Serien wie "Alias – Die Agentin", "Supernatural", "Die Liga der Gerechten" und "How I Met Your Mother" hinzufügen.
2010 wurde sie als Hauptrolle für die Drama-Serie "Happy Town" engagiert. Die Serie wurde jedoch nach acht Folgen wieder eingestellt. Privat hat die Schauspielerin ihr Glück mit dem Schauspielkollegen James Carpinello gefunden. 2003 heiratete das Paar, das gemeinsam einen Sohn und eine Tochter hat.